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Cómo se decodifica un genoma?

Ultimamente no pasa día sin que leamos o escuchemos que un nuevo genoma ha sido decodificado, o como dicen los que saben, “secuenciado”. Tal es así que hoy en día todos tenemos, en mayor o menor medida la idea de que el genoma contiene los genes, o el “set de instrucciones” necesarios para que un organismo viva, crezca y se reproduzca. Pero qué sabemos sobre cómo hacen los científicos para obtener esa información? Cómo es posible “leer” un mensaje de millones de letras escrito en diminutas moléculas de ADN encerradas en una célula? Pues veamos, pero de a poco. Primero nos enteraremos de cómo funciona el método más básico de leer el ADN, y de allí iremos avanzando.

Leer el DNA no es cosa nueva. Los primeros métodos para determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN (o para decirlo brevemente, secuenciar) fueron desarrollados a principios de la década de 1970, principalmente por Fred Sanger de Inglaterra y Walter Gilbert y Allan Maxam de los Estados Unidos. Hacia fines de la década el método de Sanger se popularizó hasta convertirse en el método estándar ya que permitía el uso de reactivos más seguros y baratos y era más versátil que el de Maxam y Gilbert. También conocido como método de terminadores de cadena, el método de Sanger fue uno de los factores que propulsaron una suerte de revolución en la biología molecular durante los 80, gracias a la cual se avanzó muchísimo en diversas áreas, incluyendo cáncer, virología y muchas mas.

La secuenciación de ADN por Sanger en su versión más moderna funciona más o menos así: Se mezcla en un pequeño tubo plástico el ADN que se quiere leer con la enzima ADN polimerasa, agua, un fragmento de ADN simple cadena llamado cebador, los 4 nucleótidos (A, C, G y T), y finalmente la clave del método que es una mezcla de los 4 nucleótidos modificados. Una vez que está todo mezclado en el tubo, el mismo se coloca en un aparato que controla la temperatura de acuerdo a las necesidades del metodo. Lo que sucede en el tubo es lo siguiente: la temperatura sube a unos 95 grados, con lo cual las dos cadenas del ADN se separan. Luego baja la temperatura, lo suficiente como para que el pequeño ADN cebador se pegue a uno de los extremos de una de las dos cadenas. Acto seguido, la temperatura sube hasta alcanzar los 72 grados, permitiendo que la ADN polimerasa comience a trabajar, agregando nucleótidos al ADN cebador usando como “molde de copia” la cadena de ADN a la cual se pegó el cebador. De esta forma, se generará una nueva cadena de ADN, de secuencia complementaria a la “molde”. Como mas de uno se habrá dado cuenta, esto se parece mucho a la base del funcionamiento de la PCR, o reacción en cadena de la polimerasa. Las diferencias con la PCR son dos. En primer lugar se utiliza un solo cebador, con lo cual no hay amplificación exponencial. En segundo lugar están los nucleótidos modificados que agregamos a la mexcla de reacción. Estos nucleótidos tienen dos diferencias con los normales. Una es que al ser incorporado en la cadena naciente de ADN por la polimerasa, el proceso de síntesis se bloquea, es decir, la polimerasa no puede agregar un nuevo nucleótido después del modificado. La segunda diferencia es que estos nucleótidos llevan un “tinte” fluorescente. Cada uno de los 4 nucleotidos (A, C, G y T) lleva un color diferente. Cuál es la consecuencia de esto? Que una vez cada tanto, la polimerasa incorporará un nucleótido modificado en lugar de uno normal, lo cual hace que la cadena que se está generando termine allí mismo. En algunos casos el nucleótido modificado se incorporará al principio y se formará una cadena muy corta, en otros casos la cadena será un poco mas larga y así hasta completar todas las posibilidades. La proporción entre las concentraciones de nucleótidos modificados y normales está sesudamente calculada como para que no haya “ni poco ni demasiado”, es decir, que se generen todas las “longitudes” posibles al terminar la reacción.

Qué pasa ahora?, nos preguntamos. Cómo leemos la secuencia? Sin apuro que falta poco. El siguiente paso es tomar nuestro tubito y llevarlo a un aparato mucho mas costoso llamado “secuenciador capilar”, que no se encuentra comúnmente en cada laboratorio, sino que es adquirido y mantenido en grandes facilidades, por ejemplo un departamento universitario, o una empresa privada, que ofrecen el servicio por   a cambio de dinero (por supuesto). El secuenciador capilar hace dos cosas. Mediante una corriente eléctrica que circula a través de nuestra muestra, ocurre lo que llamamos “electroforesis”, que no es ni mas ni menos que ordenar los fragmentos de ADN por tamaño: los fragmentos de ADN que se generaron en nuestro tubo van pasando como en una fila de niños de escuela: primero los mas cortitos, luego los mas largos. La otra cosa que hace el secuenciador capilar es “mirar” los fragmentos a medida que van pasando por un punto adonde apunta su “ojo”, que consiste en un lector de fluorescencia. Recordemos que cada uno de los cuatro nucleótidos modificados tiene un color diferente, por lo tanto el trabajo del aparato consistirá en registrar que color va pasando a medida que desfilan los fragmentos frente a su ojo. Hagamos ahora una pausa y regresemos a un concepto importante para comprender lo que sucede aquí. En la mezcla de reacción teníamos el ADN a secuenciar, que puede estar puro o no (es decir pueden haber otros ADN’s “contaminando” la muestra) y también el cebador. El cebador tiene es una molécula de ADN simple cadena de unos 18-24 nucleótidos de largo, y lo mas importante es que su secuencia está determinada y es perfectamente complementaria a uno de los extremos del ADN que queremos leer. Como consecuencia, todas las cadenas generadas en la reacción comienzan en la misma posición, es decir, están sincronizadas. Por ejemplo, la posición número 135 corresponderá al mismo nucleótido entodas las cadenas sintetizadas. Sigamos entonces. La electroforesis hace que los fragmentos vayan migrando frente al ojo, el cual registra los colores. Una posición en particular contiene un nucleótido determinado, por ejemplo, una T en posición 34. Cuando los fragmentos de longitud 34 pasen frente al lector, el mismo registrará el color correspondiente a nucleótido modificado T, ya que los fragmentos que terminan en esa posición tendrán una T allí mismo. El resultado de la “corrida” de la electroforesis es una sucesión de colores en forma de un gráfico con picos (ver figura) donde cada pico corresponde a una posición en el ADN. Dicho gráfico es interpretado por un software y la secuencia de nucleótidos es traducida a formato texto que recibimos en nuestra computadora.

Electroferograma de secuenciación de ADN por el método de Sanger (de Wikipedia)

Esto fue un resumen del método básico de secuenciación. En la siguiente entrega veremos como se ha utilizado para decodificar los primeros genomas en la década del 90 y el genoma humano, cuya secuencia fue publicada en 2001. Gracias y hasta pronto.

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